Optimalizace způsobu odběru vzorků pro monitorování viru SARS-COV-2 v odpadních vodách

Fragmenty virové RNA SARS-CoV-2 jsou vylučovány infikovanými osobami v exkrementech do odpadních vod, kde je lze detekovat metodou kvantitativní polymerázové řetězové reakce (RT-qPCR). V rámci projektu „Využití monitoringu odpadních vod jako nástroje včasného varování před vznikem epidemiologické situace“ byly v roce 2021 optimalizovány metody vzorkování odpadních vod s následnou verifikací metod na vzorcích odpadních vod odebraných v dalších vlnách epidemie.

1. Úvod

Krátce po propuknutí pandemie covid-19 se ukázalo, že vznik infekčních ohnisek není možné dostatečně efektivně sledovat pomocí současných epidemiologických přístupů, kdy se infikovaní jedinci identifikují na základě klinických projevů. Bylo zjištěno, že pro včasné varování je možné využít epidemiologický přístup k odpadním vodám (WBE, z angl. „Wastewater-Based Epidemiology“). WBE je interdisciplinární obor, sdružující odborníky z různých vědních oblastí, kteří se zajímají o rozvoj a využití kvantitativního měření lidských biomarkerů v odpadních vodách za účelem hodnocení aktuálního stavu veřejného zdraví a expozice populace nejrůznějším látkám nebo patogenům. Tento přístup se jeví jako účelný i v podmínkách České republiky, kde se aktuálně nachází 3 166 ČOV, čímž je možné podchytit situaci pro cca 80 % obyvatel České republiky.

Výzkum v oblasti WBE přístupu ve vztahu k epidemii covid-19 stále probíhá, vyvíjí se analytické metody i postupy pro odběry vzorků, které jsou nezbytnou podmínkou pro získání spolehlivých epidemiologických dat. Pro odběry vzorků jsou využívány různé postupy. Kompozitní vzorkování používá automatické vzorkovače instalované na nátoku do ČOV (převážně za česlemi), přičemž tento typ vzorku je pro analýzu výhodnější vzhledem k tomu, že poskytuje reprezentativní vzorek, který zachycuje vylučování viru obyvateli v průběhu trvání celého odběru [1]. U prostého bodového vzorkování se jedná o odběr vzorku po dobu nepřesahující 15 minut, přičemž tento typ vzorků je relevantní pouze pro přesný čas odběru a může do analýzy vnést nezanedbatelnou nejistotu. Nejistoty u prostého nebo kompozitního vzorkování byly dobře studovány pro stanovení obsahu vybraných léčiv a produktů osobní péče v odpadní vodě. K vyšší nejistotě (průměrně kolem 30 %) přispěl prostý bodový vzorek, zatímco metoda kompozitního vzorkování vykázala nejistotu < 10 % [2]. Protože defekace je u převážné části obyvatel nejčastější v časných ranních hodinách ve srovnání s jinými časy [3], je odebírání prostých bodových vzorků preferováno v dobách, kdy je fekální zatížení nejvyšší, přičemž před vzorkováním je třeba tyto časy určit [4]. V případě, že není možné pro analýzu zajistit 24h kompozitní vzorky a je nutno přistoupit k bodovému odběru, je vhodné zjistit, kdy je fekální znečistění, a s tím spojená virová nálož v odpadní vodě, nejvyšší.

Často je velmi obtížné odhadnout virovou nálož v surových odpadních vodách kvůli nedostatku informací o hodinových a dokonce sezónních změnách obsahu virových agens v odpadních vodách. Korelační analýzy naznačují, že BSK, CHSK, stejně jako fekální koliformní bakterie mohou být dobrým indikátorem virové nálože SARS-CoV-2 v komunálních odpadních vodách [5].

V rámci projektu „Využití monitoringu odpadních vod jako nástroje včasného varování před vznikem epidemiologické situace“ bylo pomocí sledování vybraných mikrobiálních a fyzikálně chemických parametrů optimalizováno vzorkování odpadních vod na ČOV o různých velikostech v České republice.

2. Materiál a metody

Vzorky byly během projektu odebírány na nátoku do ČOV (za česlemi) a jednalo se převážně o 24hodinové slévané vzorky a 18hodinové slévané vzorky odebírané během dne od 5 do 23 h. U 24hodinových kompozitních vzorků se jednalo o vzorek získaný sléváním 12 objemově stejných dílčích vzorků odebíraných po 2 h. U časových experimentů se jednalo o sérii 24 směsných hodinových vzorků (slité 4 objemově stejné vzorky vzorkované po 15 min) odebraných během 24 h. Vzorky prezentované v tomto výstupu byly odebírány automatickými vzorkovači (Hach, USA) na nátoku do ČOV. Vzorky byly do laboratoře přepraveny v chladicích boxech a zpracovány do 24 h, pro kvantifikaci genomu SARS-CoV-2 byly zmraženy na −70 °C až do zpracování.

Stanovení fosforečnanů (o-PO₄³⁻) bylo provedeno podle ČSN EN ISO 6878, stanovení nerozpuštěných látek (NL₁₀₅) podle ČSN EN 872, stanovení amoniakálního dusíku (N-NH₄) podle ČSN ISO 7150-1 a chemická spotřeba kyslíku (CHSK) byla stanovena podle ČSN ISO 15705.

Postup stanovení termotolerantních fekálních koliformních baktérií a Escherichia coli v odpadní vodě byl proveden dle ČSN 75 7835 a enterokoky byly stanovovány dle ČSN EN ISO 7899-2.

Ověření náležitého odběru vzorků odpadní vody a následujícího transportu vzorků do analytických laboratoří i vlastní průkaz a kvantifikace genomu SARS-CoV-2 v odpadní vodě bylo provedeno dle Metodického postupu analýzy odpadní vody na přítomnost specifických oblastí genomu SARS-CoV-2 [6].

3. Výsledky a diskuse

U dvou ČOV na kterých probíhaly časové experimenty, byl podíl průmyslových vod na nátoku podobný (kolem 30 %), lišily se však velikostí (ČOV „L1“ 640 000 ekvivalentných obyvatel, ČOV „M1“ 34 000 ekvivalentných obyvatel). U ČOV „L1“ byla zjištěna silná korelace mezi indikátory fekálního znečistění a chemickými ukazateli znečistění, přičemž korelační koeficienty se pohybovaly mezi 0,76–0,91 (Obr. 1). U ČOV „M1“ nebyla pozorována korelace mezi fekálními koliformními bakteriemi a chemickými parametry, ale množství enterokoků v odpadní vodě odpovídalo chemickému znečištění (korelační koeficienty se pohybovaly v rozmezí 0,68–0,80) (Obr. 2). Během monitoringu na těchto dvou ČOV byly zjištěny rozdíly v mikrobiálním znečistění odpadní vody v průběhu dne, přičemž přibližně 70 % denního znečištění vstoupilo do čistírny mezi 10. a 21. hodinou (Obr. 1 a 2).

Obr. 1: Časové změny mikrobiálních a fyzikálně-chemických parametrů v hodinových vzorcích odebraných 2. 2. 2021 na nátoku ČOV „L1“

Rolland a kol. [7] ve své studii zjistil, že v surové odpadní vodě bylo nejvyšší fekální znečistění stejně jako i koncentrace virů stanoveno mezi 10. a 14. hodinou, což odpovídá předpokládanému chování obyvatelstva. Vzorkování v našem případě bylo realizováno v únoru 2021, kdy byl zaveden v ČR mimořádný režim – probíhala distanční výuka na školách a současně mnoho zaměstnanců pracovalo z domova, což mohlo do jisté míry ovlivnit užívání kanalizace obyvateli. Je také třeba vzít v úvahu, že dobu nejvyššího fekálního znečištění na přítoku na ČOV ovlivňuje nejen chování napojených obyvatel, ale i délka kanalizační sítě a doba dotoku na ČOV.

Kromě výše zmíněného, mohou mikrobiální fekální znečistění ovlivnit srážky nebo nárazové vypouštění průmyslových odpadních vod. Změny ve fekálním znečistění surové odpadní vody byly pozorovány i v našem případě na ČOV „M2“ (Obr. 3). Je proto potřebné při monitoringu viru SARS-CoV-2 brát v potaz i denní průtoky na přítoku na ČOV, čím bude možné zohlednit výkyvy v systému [8].

Obr. 2: Časové změny mikrobiálních a fyzikálně-chemických parametrů v hodinových vzorcích odebraných 3. 2. 2021 na nátoku ČOV „M1“

Obr. 3: Mikrobiální znečistění 24h kompozitních vzorků surové odpadní vody z ČOV „M2“

Také teplota byla identifikována jako významná proměnná. Ovlivňuje perzistenci virů v životním prostředí, přičemž vyšší rychlosti rozpadu jsou obvykle pozorovány při teplotách nad 20 °C, ve srovnání s teplotami pod 15 °C [9, 10]. Kvantifikace rychlosti rozpadu RNA SARS-CoV-2 mezi vylučováním stolicí a dobou odběru vzorku je pro WBE důležitá, protože může vést k systematickému zkreslení výsledků, což následně může mít dopad na jejich interpretaci. Z literatury [11] bylo zjištěno, že pro RNA SARS-CoV-2 v surové odpadní vodě byly průměrné konstanty rychlosti rozpadu prvního řádu (k) 0,084/den při 4 °C; 0,114/den při 15 °C a 0,286/den při 37 °C.

Jak bylo pozorováno na ČOV „S1“, i ve dnech, kdy teplotní maximum vzduchu dosáhlo 15 °C, vystoupala průměrná teplota odpadní vody na přítoku až na 15,5 °C (Tab. 1). V letních měsících by problém se zvýšenou teplotou při vzorkování 24h kompozitního vzorku mohlo vyřešit použití chlazených automatických vzorkovačů, které ale představují mnohem vyšší vstupní náklady pro vzorkování.

Vzhledem k výsledkům časového monitoringu byl pro monitoring SARS-CoV-2 RNA vybrán zkrácený režim vzorkování (5–23 h). Výsledky pro tyto vzorky byly srovnány s výsledky 24h směsných vzorků typu B (směsný 24hodinový vzorek získaný sléváním 12 objemově stejných dílčích vzorků odebíraných po 2 hodinách) nebo C (směsný 24hodinový vzorek získaný sléváním 12 průtokově závislých dílčích vzorků odebíraných po 2 hodinách). Jak je patrné z grafu (Obr. 4), poskytovaly 18h směsné vzorky lepší výsledky než standardně používané 24h směsné vzorky. Ve dvou případech nebyla virová RNA ve 24h směsných vzorcích vůbec detekována, zatímco z 18h směsných vzorků se ji podařilo izolovat. Zkrácení doby vzorkování tak může být vhodné např. pro potřeby sekvenace vzorků, v případech, kdy je prevalence nakažených v oblasti nízká.

Obr. 4: Vliv doby vzorkování na virovou nálož ve vzorcích (x-ová osa označuje identifikaci ČOV a vzorkovací týden)

4. Závěr

Nezbytnou součástí monitoringu přítomnosti koronaviru SARS-CoV-2 v odpadních vodách je zajištění pravidelného odběru vzorků. Pro získání přesných výsledků a správnou interpretaci dat je nezbytným předpokladem zajištění vhodných podmínek (např. chlazení během vzorkování nebo úprava času vzorkování) pro odběr vzorků. Úpravou doby vzorkování se může dosáhnout zvýšení výtěžnosti virové RNA ze vzorků odpadních vod.

5. Literatura

1. KWR WATER RESEARCH INSTITUTE, SOP wastewater sampling, transport, storage for SARS-CoV-2 RNA assays, available online, 2020
2. ORT, C. & kol. Sampling for PPCPs in wastewater systems: comparison of different sampling modes and optimization strategies, Environmental Science & Technology, 2010
3. HEATON, K. & kol. Defecation frequency and timing, and stool form in the general population: A prospective study, Gut, 1992
4. AHMED, W. & kol. Surveillance of SARS-CoV-2 RNA in wastewater: Methods optimisation and quality control are crucial for generating reliable public health information, Current Opinion in Environmental Science & Health, 2020
5. NAVARRO, R. & kol. SARS-CoV-2 in wastewater from Mexico City used for irrigation in the Mezquital Valley: Quantification and modelling of geographic dispersion. Online, 2021
6. VAŠÍČKOVÁ, P. & kol. Metodický postup analýzy odpadní vody na přítomnost specifických oblastí genomu SARS-CoV-2, 2021
7. ROLLAND, D. & kol. Sampling strategy for detecting viruses in a sewage treatment plant, Applied and Environmental Microbiology, 1983
8. MELVIN R. G. & kol. Predictive power of SARS-CoV-2 wastewater surveillance for diverse populations across a large geographical range, Online, 2021
9. KORAJKIC, A. & kol. Persistence and decay of fecal microbiota in aquatic habitats. Microbiology and Molecular Biology Reviews., 2019
10. MUIRHEAD, A. & kol. Zika virus persistence in sewage. Environmental Science & Technology Letters, 2020
11. AHMED W., & kol. Decay of SARS-CoV-2 and surrogate murine hepatitis virus RNA in untreated wastewater to inform application in wastewater-based epidemiology, Environmental Research, 2020

Poděkování

Práce vznikla za podpory projektu VI04000017 „Využití monitoringu odpadních vod jako nástroje včasného varování před vznikem epidemiologické situace“ programu 4. VS BV III a institucionálních prostředků MŽP. Autoři děkují provozovatelům ČOV za vstřícnou spolupráci při poskytování vzorků odpadní vody.